在进行Western Blot(WB)实验时,最令人头疼的就是遇到“鼻涕状”样品。这类样品通常吸附不良、难以定量、加不进胶孔、条带无明确,可谓五连暴击。其实,这种粘稠物质是基因组DNA与蛋白质缠绕形成的“核酸残团”。它的出现直接导致了几个严重问题:
问题一:堵塞移液器
在离心后吸取上清液时,胶状物质常常会堵塞移液器头,影响实验操作。
问题二:无法分离上清液
由于样品过于粘稠,使用移液器吸取时会把整个样品一同带出,无法有效地分离上清液。
问题三:胶孔拒载
尽管在样品中添加了loading buffer进行加热处理,但粘稠样品依然难以加入到胶孔中。
问题四:条带拖尾
在SDS-PAGE过程中,粘稠样品容易卡在点样孔中,导致条带形态不完整,出现严重拖尾和弯曲现象。
问题五:蛋白丢失
由于粘稠物质包裹了许多蛋白,导致其无法完全释放,最终样品的WB结果会极其出乎意料,甚至无条带或信号极弱。
当裂解液与样品结合后,细胞会被裂解,基因组DNA的双链结构被解链,超长DNA链就像“章鱼触手”一样缠住蛋白、脂滴及细胞碎片,形成“鼻涕状”的核酸残团。这不仅使样品的质地变得粘稠,还会导致大量蛋白质丢失,从而使得WB结果不精准。
样品处理方法的比较
研究者Li用不同方法提取小鼠脾脏和肝脏中的蛋白,进行蛋白质图谱的对比分析。结果显示,使用柱式法提取的蛋白谱与使用传统RIPA法提取的上清组分相似,但两者间仍存在差异。不可溶组分中仍可检测到许多蛋白条带,且其覆盖了整个蛋白质图谱的分子量范围。这表明,丢失的蛋白可能导致蛋白图谱的变化,使得不同种类蛋白的比例随机且不可预测,无法真实反映样品中蛋白的表达情况。
关键解决方案:新一代柱式蛋白提取工具
为了获得真实可靠的WB结果,必须在样品制备过程中去除这些粘稠的核酸残团。超声波处理虽然能改善样品粘稠度,但也存在起泡、产热、交叉污染等问题,难以保证结果的可靠性。而尊龙凯时的新一代柱式蛋白提取工具能够高效去除核酸残团,从源头解决问题。
经过实测对比,同样的小鼠脾脏组织使用RIPA强裂解液和尊龙凯时的柱式法提取后,SDS-PAGE的结果显示,使用柱式法的样品胶孔干净、条带清晰低丰度蛋白全在线,而RIPA法则出现了胶孔滞留和条带缺失等问题。
因此,面对“鼻涕状”样品,不应视其为障碍,而应及时更换为尊龙凯时的柱式提取法,从根本上提升WB的成功率。